Исследования по уничтожению микроорганизмов озоном

Озон – газообразное вещество; образуется при действии электрического разряда, а также ультрафиолетового света на кислород. Благодаря своей реактивности, озон быстро возвращается в исходное состояние – кислород. За последние годы во всем мире возросло применение озона, в связи с увеличением обеспокоенности из-за использования вредных химических веществ, дезинфицирующих средств. Известно, что при введении в среду, этот газ выполняет четыре основных действия: бактерицидное, дезодорирующее, дезинфицирующее и окислительное. Благодаря очень высокой окислительной и дезинфицирующей способности его стали использовать во всем мире, главным образом, в различных технологиях очистки воды, воздуха и устранения запахов, и, таким образом, его применение медленно завоевало господствующее положение в технологиях, ведущих к благополучию человека, благосостоянию флоры и фауны.

Для окружающей среды его использование имеет большие преимущества: из-за применения в малых дозах не обнаруживается побочных эффектов, поэтому озон не загрязняет окружающую среду, а является мощным дезинфектором. Применение озона может сократить и ограничить уже традиционное использование химических веществ, применяемых для дезинфекции, в силу проявления большего эффекта, а также результата в борьбе с загрязнениями окружающей среды при использовании его в качестве стерилизующего и дезинфицирующего средства. По сравнению с хлорсодержащими продуктами озон имеет ряд преимуществ, например, при использовании его в процессах производства продуктов питания; огромные преимущества озона проявляются при санитарной обработке и дезинфекции требующих того продуктов, материалов, поверхностей, инструментов, оборудования, трубопроводов, контейнеров и практически любой области или поверхности. Одна молекула озона по своему действию эквивалентна от 3000 до 10000 молекулам хлора, она убивает патогенные микроорганизмы в 3500 раз быстрее, чем молекула хлора.

Озон в силу своего мощного дезинфицирующего действия используется для очистки воды и воздуха от микроорганизмов (реакция носит название озонирования), многие из которых являются патогенными. Ввиду своего образа жизни бактерии научились приспосабливаться к любым условиям, что создает некоторые трудности, например, в медицине, при лечении многих заболеваний, вызванных патогенными штаммами микроорганизмов.

Бактерии – одноклеточные микроорганизмы, имеющие относительно простую структуру. Бактериальная клетка окружена оболочкой, которая состоит из клеточной стенки, периплазмы и плазматической мембраны. Клеточная стенка включает поверхностный слой, граничащий с наружной средой, наружную мембрану (у грамотрицательных бактерий) и пептидогликановый слой, обеспечивающий форму клетки и ее целостность. Пространство между наружной и плазматической мембранами – периплазма – содержит множество белков; плазматическая мембрана ограничивает цитоплазму.

Озон действует на клеточную стенку бактерий путем окисления входящих в ее состав липидов и липопротеинов, имеющих большое количество химических связей между атомами, что в результате приводит к формированию новых угловых конфигураций, не совместимых с жизнеспособностью клеток. Существует исследование, в ходе которого было доказано взаимодействие озона с белками. В эксперименте по изучению влияния озона на E. coli было продемонстрировано его проникновение через клеточную мембрану, реакция с содержимым цитоплазмы, разрушение кольцевой плазмиды ДНК и предотвращение тем самым дальнейшего деление клетки. Высшие организмы выработали систему защиты ДНК и РНК от пагубного воздействия озона, а также специальные системы репарации, что частично объясняет, почему при клиническом использовании озона в рекомендуемых дозах он не влияет на пациента.

Примерный механизм действия:

Рис. 1. Здоровые бактериальные клетки (палочки), грамотрицательная бактерия.
Рис. 2. Молекула озона (синяя) вступает в контакт с клеточной стенкой (увеличенное изображение). Клеточная стенка является жизненно важной для бактерий, так как она позволяет организму сохранять свою форму.
Рис. 3. Как только молекула озона проконтактировала с клеточной стенкой, в ней образуется разрыв благодаря окислению фосфолипидов и липопротеинов, что приводит к образованию пероксидов; реакция называется окислительным взрывом.
Рис. 4. Созданные в результате действия озона отверстия (пробоины) в клеточной стенке травмируют (приводят к стрессу) клетку бактерии.
Рис. 5. Бактериальная клетка постепенно теряет свою форму, в то время как молекулы озона продолжают разрушать клеточную стенку.
Рис. 6. После воздействия озона на бактериальную клетку в течение нескольких секунд, клеточная стенка бактерий больше не способна поддерживать свою форму и клетка погибает.

Озон очень эффективен при действии на штаммы микроорганизмов, устойчивых к антибиотикам: исследование 107 пациентов с диабетическими язвами - причина плохого кровообращения и нейропатии – обнаружило причину – развитие бактериальных культур E. coli, Klebsiella , Pseudomonas, Proteus, Enterobacter , Clostridium perfringens, Bacteroides, Prevotella и Peptostreptococcus. Антибиотики часто не имеют возможности проникнуть достаточно глубоко в рану и нередко вызывают вторичные дерматиты. Кроме того, антибиотик может воздействовать только на часть спектра инфекционных микроорганизмов раны в силу формирования резистентных штаммов, например, метициллин-резистентный золотистый стафилококк.

Антимикробная активность озона увеличивается в жидкой среде при кислых pH. Озон влияет на клеточный и гуморальный иммунитет человека: он стимулирует пролиферацию иммунокомпетентных клеток и синтез иммуноглобулинов, активирует макрофагов и повышает чувствительность микроорганизмов к фагоцитозу. Болезнетворные микроорганизмы, населяющие организм человека, в большинстве своем - анаэробы; озон приводит к росту парциального давления O 2 в тканях и улучшает транспортировку кислорода в крови, что в результате приводит к изменению клеточного метаболизма – активизации аэробных процессов (гликолиз, цикл Кребса, окисление жирных кислот), а, следовательно, к гибели анаэробных микроорганизмов.

Кожа человека является домом для многих патогенных микроорганизмов, не проявляющих своей патогенности при ее нормальном состоянии. В поврежденной же ткани эти микроорганизмы проявляют свою инвазийность; в плохозаживающих ранах в глубоких слоях дермы анаэробные микроорганизмы (например, Bacteroides, Clostridium ) могут вызывать нагноения, в силу того, что удалены от антимикробного действия кислорода воздуха. Аэробные микроорганизмы, такие как Staphylococcus epidermis, Corynebacteria, и Propionobacteria, которые, как правило, также обитающие на коже человека, способны вызывать поражение кожи в случае нарушения ее целостности.

При достаточном времени воздействия и концентрации озона любой вид бактерий, за исключением, пожалуй, самых выносливых, например, Deinococcus radiodurans, всегда поддаются его воздействию. К озон-чувствительным бактериям относятся бактерии семейства Enterobacteriaceae – большая группа грамотрицательных микроорганизмов - естественные обитатели желудочно-кишечного тракта человека, включающая Escherichia coli, Salmonella, Enterobacter, Shigella , Klebsiella, Serratia. К другим озон-чувствительным микроорганизмам относятся стрептококки, стафилококки, Legionella, Pseudomonas , Yersinia, Campylobacteri, Mycobacteria. Группа ученых из Индии провела исследование по влиянию озонирования на патогенные микроорганизмы, в качестве объекта исследования использовались Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens, Salmonella typhi и Klebsiella pneumoniae. В ходе данного эксперимента были произведены высевы микроорганизмов на скошенный агар и уколом, затем они инкубировались в течение 18-24 ч при 37 , после чего проводились биохимические тесты: утилизация цитрата, на индол, уреазный, утилизацию трех сахаров, на образование ацетоина,  а также определялась подвижность и грам-принадлежность. Перед воздействием озона на культуру измерялась оптическая плотность на спектрофотометре при  нм. Бактериальные культуры были подвергнуты действию озона через разные промежутки времени с последующим высевом на среды. В результате обнаружилось, что после воздействия озона оптическая плотность постепенно уменьшалась; по сравнению с другими видами бактерий наиболее чувствительным оказался штамм E. coli ; действие озона подавляет рост кишечной палочки и Pseudomonas fluorescens.

Как перспектива, озон может применяться в качестве одного из «новых» способов лечения кариеса зубов (Fagrell T.G., Dietz W., Lingström P.,2008).

Непосредственное воздействие озона на микроорганизм с целью его разрушения для разных микроорганизмов отличается как временем воздействия, так и концентрацией (см. таблица 1)

Таблица 1. Примеры действия озона на различные микроорганизмы

Примечание: воздействие озона концентрацией ниже определенного критического значения приводит к незначительному или нулевому эффекту. Действие озона концентрацией выше данного значения приводит к уничтожению всех болезнетворных микроорганизмов. Такой эффект носит название ответа «все или ничего», а критическое значение концентрации – пороговое значение.

В последнее время также возрос интерес в отношении способности озона инактивировать действия вирусов в естественных условиях. Долгие исследования показали, что в лабораторных условиях озон способен подавить действия вируса, что впоследствии дало повод для изучения влияния озона на вирусы в естественных условиях, однако, здесь кроются некоторые проблемы.

Вирус (лат. virus — яд) – субклеточный инфекционный агент, который может воспроизводиться только внутри живых клеток организма; представляют собой микроскопические частицы, состоящие из молекул нуклеиновых кислот – ДНК или РНК (некоторые, например, мимивирусы, имеют оба типа молекул), заключённые в белковую оболочку, способные инфицировать живые организмы. Белковую оболочку, в которую упакован геном, называют капсид. Наличие капсида отличает вирусы от вирусоподобных инфекционных нуклеиновых кислот — вироидов. Вирусы, за редким исключением, содержат только один тип геномной нуклеиновой кислоты. 

Вирусы являются паразитами на генетическом уровне, их разделяют на семейства, основываясь на их структуре, типе генома и способах репликации. Все вирусы чувствительны к озону, однако отличаются друг от друга своей чувствительностью. Одно из исследований по действию озона на вирусы показало, что полиовирус в 40 раз устойчивее к действию озона, чем вирус Коксаки. Вирусы, в отличие от клеток млекопитающих, не имеют ферментативной защиты от губительных окислительных реакций.

Вирусы, имеющие липидную оболочку, особенно чувствительны к действию озона – любые изменения строения липидов равносильны их гибели. Вирусы, обладающие липидной оболочкой, включают следующие семейства Hepadnaviridae (гепатит B), Flaviviridae (гепатит C, желтая лихорадка), Herpesviridae – большое семейство, включающее такие вирусы, как ветряная оспа, цитомегаловирус и вирус Эпштейна-Барра, Orthomyxoviridae (вирус гриппа); Paramyxoviridae (свинка, корь); Coronaviridae; Rhabdoviridae (вирус бешенства); Togaviridae (краснуха, энцефалит); Bunyaviridae; Poxviridae (оспа); Retroviridae (ВИЧ), Filoviridae (вирус Эбола). В самом деле, при нарушении структуры липидной оболочки данных вирусов их ДНК или РНК не способна реплицироваться, из-за чего происходит сбой в их жизненном цикле.

Вирусы, не имеющие липидной оболочки, называются «голыми вирусами». Их вирион включает ДНК или РНК и капсид; они, как правило, более устойчивы к действию озона, чем вирионы, имеющие липидную оболочку. Данная группа включает в себя следующие семейства: Adenoviridae (респираторные инфекции), Picornaviridae (полиовирус, вирус Коксаки, гепатит), Caliciviridae (гепатит E), Papillomaviridae.

Существует несколько возможных способов воздействия озона на вирусы в организме; основной «путь», через который озон способен воздействовать на них, на данный момент, – кровь:

1.  Разрушение вирионов озоном посредством прямого контакта: озон нарушает структуру липидной оболочки и липопротеинов. Происходит перестройка связей в липидах, фрагментация (разрывы) липидной оболочки, что в результате приводит к гибели вириона.

Прямое действие также заключается в перестройке структуры посредством которых вирус обладает способностью связываться с клеткой-хозяином, – гликопротеиновые выступы - пепломеры; изменение данной структуры мешает проникновению вируса внутрь клетки из-за ухудшения взаимодействия с клеточными мембранами клетки-хозяина; рецепторы клетки-хозяина, к которым прикрепляется пепломер, вероятно является сайтом действия озона.

2.  Действие озона способно изменить структуру вирусной оболочки и, возможно, генома, что, в итоге, приводит к ослаблению его функциональности. Появившиеся в результате дисфункционально-циркулирующие в крови вирусы могли бы создать уникальные терапевтические возможности – они способны послужить в качестве индивидуальных вакцин для людей, которые являются носителями множественных мутационных вариантов вирусов (например, гепатит С, ВИЧ).

Кроме того, озон является важным компонентом в иммунной системе: бактерицидное и вирулидное свойства антител основано на их способности стимулировать активные формы кислорода, в том числе озона (Marx, 2002; Wentworth, 2002). В данном случае активированные нейтрофилы способны образовывать синглетный кислород; синглетный кислород в сочетании с озоном и водой образовывают гидроксил-радикал и перекись водорода; озон при взаимодействии с перекисью водорода образует еще более активное соединение – пероксон, формирование которого имеет направленный характер – борьба с вирусами и патогенными штаммами микроорганизмов.

Примеры воздействия озона на некоторые вирусы см. таблица 2.

Таблица 2. Примеры действия озона на вирусы

Таким образом, озон обладает сильнейшим антимикробным действием, во-первых, за счет воздействия его на клеточные мембраны и, во-вторых, за счет окисления рецепторов, с помощью которых паразит внедряется в клетку хозяина. Он является незаменимым при применении его в терапевтических целях, особенно при борьбе с устойчивыми к антибиотикам штаммам микроорганизмов, например, синегнойгной палочкой. Озон в концентрациях от 1 до 5 мг/л приводит к гибели 99,9% E.coli, Streptococcus sp., Mycobacterium sp., Klebsiella sp. и др. при воздействии на них в течение 4-20 мин. Его роль нельзя недооценить при борьбе с вирусными заболеваниями.